LSIVET 猪细小病毒病ELISA检测试剂盒

1 板（96 份）

用于单一猪血清或血浆

一、简介

猪细小病毒（PPV）引起的猪繁殖障碍，主要表现为胎儿感染和死亡。病毒在猪群中普遍存在并在大部分猪群中检测到。诊断调查表明PPV 是引起胚胎和胎儿死亡的主要传染病。

在繁殖障碍疾病鉴别诊断中，可以通过胚胎或胎儿死亡或两者均存在等症状诊断出PPV。缺乏母源疾病，流产，胎儿畸形可以用来区分PPV 和大多数其它引起繁殖障碍的传染病。但是，明确诊断需要实验室结果的支持。在免疫计划的控制和非免疫群疾病诊断中，抗PPV 抗体的检测和滴度测定对畜群免疫水平的监测而言，是一个非常有用的技术。本试剂盒可以替代HI 测定，用于免疫和非免疫群PPV 血清学诊断。

二、实验原理

此试剂盒为间接ELISA 方法。

1、 样品和对照加入到包被有PPV 抗原的微量板中。如果抗体存在，此特异性抗体与PPV 结合

形成抗原-抗体复合物。

2、 洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG 单克隆抗体，与板中的抗体结合。

3、 洗掉未结合的酶标抗体，加入底物溶液，颜色呈现绿色。

4、 加入终止液后，颜色变成深绿色。在酶标仪上进行读板。

阳性样品呈绿色，颜色的深浅与样品中的PPV 抗体量呈正比。

三、试剂盒组成

－试剂1：(Coated microplate PPV)检测PPV 抗体的包被板：8 孔12 条的ELISA 微量板

－试剂2：(Negative C. PPV)PPV 阴性对照

－试剂3：(Positive C. PPV)PPV 阳性对照

－试剂4：(Conjugate 100╳ PPV)PPV 辣根过氧化物酶（100 倍）

－试剂A：(Wash 10╳)洗液（10 倍）

－试剂B：(Dilution Buffer 5╳ PPV)样品稀释液 （5 倍）

－试剂C：(Substrate)底物液（ABTS），直接使用

－试剂D：(Stop PPV)终止液(草酸)，直接使用

－封板膜：2

－试剂盒说明书

－出厂证明书

四、用前准备：

1．仔细阅读说明书。所有试剂在5＋3℃条件下保存。不用时，所有的板条一定要用用封口膜密封，并存放在封口的塑料小袋中，5＋3℃条件下保存。

2．不要将不同批次的试剂和说明书混放。

3．防止真菌和细菌污染试剂盒中的成分。

4．不要用嘴吸液。

5．佩戴合适的防护用具：手套，面罩，眼镜。

6．避免底物和终止液溅入眼睛和皮肤，如果溅入立即用水清洗。

7．所有废弃试剂进行无害化处理。

8. 本品仅为兽用体外产品。

五．必需的但没提供的设备

1．精确移液器 2．一次性吸头 3．稀释板 4．蒸馏水 5．微量板孵育器（37＋2℃） 6．酶标仪405nm 7．一次性容器

六、样品的准备：

新鲜、冷藏（8 天5＋3℃）或冷冻（1 年－20℃）血清或血浆可用于检测。

筛选：单个血清或血浆样品需用1 倍样品稀释液进行1/200 倍稀释。

七、试剂的准备

---包被板，底物和终止液：直接使用。

---阴性对照，阳性对照操作方法与样品相同。

---稀释液（5 倍）（试剂B）:用蒸馏水1/5 倍稀释。例如：10ml（5 倍）稀释液加入40ml 蒸

---馏水中，混匀。配好的液体在5±3°C 保存，8 天内用完即可。

---洗液（10 倍）（试剂A）：1/10 用蒸馏水进行稀释

例如：对于1 条：取2ml 洗液加入18ml 蒸馏水。

对于1 板：取25ml 洗液加入225ml 蒸馏水

配好的液体在5±3°C 保存，1 个月内用完即可。

--- PPV 辣根过氧化物酶（100 倍）（试剂4）：用稀释液进行1/100 倍稀释。稀释后的酶标抗体立即使用。

筛选：单个血清或血浆样品需用1 倍样品稀释液进行1/200 倍稀释。以下为二步稀释法。

A. 将样品用1 倍样品稀释液在预稀释板中进行1/20 倍稀释。例如：

1、 在预稀释板中加入5ul 血清、阴性对照和阳性对照。此加样顺序可用于包被板中的顺序。

2、 在按照顺序加入95ul 样品稀释液（1 倍），轻轻混匀。

3、 转移到包被板前，让稀释好的血清在室温下平衡5 分钟。

注：稀释好的血清应保存于5＋3℃，并于24 小时之内检测。

B. 将样品用1 倍样品稀释液在PPV 包被板中进行1/10 倍稀释。

稀释前将预稀释板轻轻混和。

1、 将10ul 1/20 预稀释的血清、阴性对照和阳性对照，加入包被板板孔中。

2、 将90ul 稀释液（1 倍）加入相应的样品孔中。轻轻混匀。

对于滴定法，我们建议样品从1/200 开始进行2 倍的倍比稀释至1/12800。

八、操作步骤

提示：所有的试剂将置于室温（21±4°C）下平衡，至少30分钟。孵育时间的偏差为±10％。

对于从瓶中倒出的样品稀释液、酶标抗体、底物和终止液使用后剩余液体应弃去，不准倒回瓶中。

对照和样品的布局

1、 筛选：

对照和样品均用稀释液（1 倍）进行1/200 稀释。

将1/20 预稀释 的PPV 阳性对照加入A1 和B1 孔中，各10ul；

将1/20 预稀释的PPV 阴性对照加入C1 和D1 孔中，各10ul；

将1/20 预稀释的样品加入剩余孔中，各10ul；

在以上每个孔内分别加入90ul 的稀释液（1 倍）。

轻轻混匀，盖上封板膜。在37±2°C.条件下孵育 1 个小时。

2、 滴度测定：对照1/200 进行检测。

例如：每孔100ul，从1/200 进行倍比稀释到1/12800（每个样品一个板条）轻轻混匀，盖上封板膜。在37±2°C.条件下孵育 1 个小时。

洗板

弃去板中液体，用已配制好的洗液进行洗板，洗4 次。每个孔大约300ul。最后一次排干。

加入酶标记物

每个孔分别加入100ul稀释好的辣根过氧化物酶。轻轻混匀，盖上新封板膜，在室温下21±4°C.

条件下孵育1个小时。

洗板

弃去板中液体，用已配制好的洗液进行洗板，洗4 次。每个孔大约300ul。最后一次排干。

显色

每个孔分别加入100ul的底物液（试剂C）。轻轻混匀2秒钟，在室温21±4°C.条件下避光孵育

10分钟，此步骤不需要盖封板膜。

每孔分别加入100ul 终止液（试剂D）。加入的顺序同加入底物的顺序相同。混匀2 秒钟。

读板

用软纸擦拭板底的灰尘。选择酶标仪405nm波长进行读取。

九、结果的计算

计算阴性对照平均OD 值：ODmNC

计算阳性对照平均OD 值：ODmPC

S/P=(样品OD 值- ODmNC)/( ODmPC- ODmNC)

提示：如果阴性样品，可能会得到负的S/P 值。

十、实验成立条件：

ODmPC>1.0

ODmPC- ODmNC >0.7

如果试验无效，重新阅读操作说明书进行重复检测。

十一、结果说明：

1、 筛选

1/200 稀释样品时，结果表显示与HI 试验相关性。

样品S/P<0.150 时，为阴性，对应的HI 滴度被认为是非特异的结果。

LSIVET 猪细小病毒试剂盒能够区分疫苗免疫动物和感染动物。

样品的稀释范围是1/200 到1/12800，当样品的S/P 值大于1.0 时，通过样品滴度的梯度稀释，精确与HI 滴度的相关性。

样品滴度的确定：S/P 值大于0.15 时，样品滴度梯度稀释的最大稀释度判定为样品滴度。根据下表找到对应的相关HI 滴度。